Per questo motivo in condizioni estreme di fermentazione come quelle descritte, alle quali si possono aggiungere le basse temperature, la scelta del ceppo di lievito adatto, resistente agli stress e in grado di svolgere il proprio metabolismo primario e secondario in modo regolare, risulta fondamentale. Un caso particolare che riassume in sé la maggior parte delle condizioni sfavorevoli per il metabolismo del lievito è quello della fermentazione delle uve sottoposte all’appassimento per la produzione di vino Amarone della Valpolicella. Dalle uve delle varietà Corvina, Corvinone e Rondinella, raccolte a maturazione nel periodo di settembre-ottobre e lasciate ad appassire in fruttaio fino al dicembre o al gennaio successivi al raggiungimento di un calo in peso di circa il 30-40%, si ottengono mosti molto concentrati, talvolta caratterizzati, in caso soprattutto di presenza di Botritys cinerea in forma manifesta o larvata, da un basso contenuto in azoto assimilabile. Nella loro fermentazione oltre allo stress osmotico delle prime fasi e all’elevata concentrazione alcolica delle fasi successive, i lieviti devono affrontare carenze di tipo nutrizionale e nel caso di fermentazioni svolte in assenza di controllo della temperatura, sono costretti a svolgere il loro metabolismo nei mesi più freddi dell’anno e quindi a basse temperature. Il rischio in queste condizioni non è solo quello di avere delle fermentazioni incomplete, ma può essere rappresentato anche dalla produzione di metaboliti secondari indesiderati e responsabili di off flavors come l’acido acetico o l’idrogeno solforato, che si formano rispettivamente in condizioni di stress osmotico e di bassa disponibilità di nutrienti azotati.
Un ceppo di lievito adatto alle condizioni di fermentazione difficili come quelle presenti nella fermentazione delle uve destinate alla produzione dell’Amarone sarà quindi quello in grado di dare fermentazioni complete, senza deviazioni gusto-olfattive e allo stesso tempo di contribuire positivamente all’espressione del profilo organolettico del vino, con la produzione e la liberazione di composti aromatici fermentativi e varietali desiderati.
Il Dipartimento di Biotecnologie dell’Università di Verona e il Dipartimento di Ricerca e Sviluppo della società Tebaldi srl di Colognola ai Colli (VR) hanno realizzato nel 2017 uno studio con lo scopo di verificare le performance del ceppo di lievito commerciale di Saccharomyces cerevisiae ExperTi Record, in vini ottenuti da uve sottoposte ad appassimento in termini di performance fermentative e di produzione di metaboliti secondari ad attività aromatica in relazione alla componente azotata dei mosti. Le caratteristiche compositive dei mosti di partenza con la loro diversa origine e profilo compositivo e profilo analitico influenzano infatti in maniera determinante la capacità del lievito di completare la fermentazione alcolica e di produrre metaboliti secondari.
Per la prova svolta presso i laboratori dell’Università sono stati utilizzati cinque diversi lotti di uva (tre di sola Corvina, uno di Corvinone e Rondinella e uno di Corvina mista alle altre varietà), provenienti da zone diverse della Valpolicella, raccolti nella vendemmia 2016 e successivamente sottoposti ad appassimento presso i produttori (Fig. 1). I mosti ottenuti da ciascun lotto differivano per la concentrazione zuccherina e per il contenuto in azoto prontamente assimilabile (Tab. 1) e il loro utilizzo nelle tesi della prova sperimentale consente di conseguenza di valutare la risposta fermentativa e metabolica del lievito in cinque distinti scenari nutrizionali. Le prove di micro-vinificazione sono state realizzate in doppio in fermentatori da 5 litri, inoculate con il lievito oggetto della prova e mantenute a temperatura costante di 25 +/- 3°C con monitoraggio giornaliero della temperatura e dell’andamento fermentativo valutato mediante la misura periodica del calo in peso. In nessuna delle prove sono state fatte aggiunte e correzioni di nutrienti azotati.
La fermentazione si è completata per tutti i campioni in un periodo compreso tra i 9 e i 14 giorni (Fig. 2) con i tempi più brevi riscontrabili nei lotti caratterizzati da un contenuto in azoto disponibile più elevato. Solo nei mosti più carenti in azoto e contemporaneamente con concentrazione in zuccheri molto elevata il consumo degli zuccheri non è stato completo, con residui massimi tuttavia non superiori ai 10 g/l nel lotto 3, caratterizzato da un APA iniziale molto basso (69 mg/l). Confrontando i valori di APA dei mosti con i profili fermentativi e con il residuo zuccherino finale è possibile valutare l’influenza di questo parametro sul decorso delle fermentazioni (Fig. 3). A differenza di quanto talvolta riportato in letteratura sulla relazione tra lo stress osmotico e la produzione di acido acetico in Saccharomyces cerevisiae, un aspetto particolarmente significativo e degno di essere messo in evidenza è il basso contenuto in acido acetico nei vini finiti, a testimonianza dell’ottima attitudine enologica del ceppo in esame. Anche in questo caso i valori più bassi sono stati riscontrati nelle fermentazioni con APA superiore ai 250 mg/l.
La produzione dei metaboliti secondari e l’influenza sulle caratteristiche aromatiche dei vini La produzione di H2S nel corso della fermentazione è stata monitorata con un metodo colorimetrico ed evidenzia come la risposta del ceppo ExperTi Record sia solo in parte legata ai livelli di APA iniziale, essendo assente nel mosto con APA più elevato e sviluppandosi solo nelle ultime fasi in quello più carente, ma evidenziando al contempo livelli mediamente elevati e costanti nel lotto 2, con un valore medio di 155 mg/l di Azoto assimilabile (Fig. 4). Tali dati suggeriscono l’influenza anche di altri fattori già riportati da diversi autori, nel determinare lo sviluppo fermentativo di H2S, come il contenuto in cisteina e in glutatione nelle uve o la presenza di zolfo elementare. I valori assoluti rilevati, così come l’assenza di idrogeno solforato a fine fermentazione nei vini finiti, consentono di classificare il ceppo ExperTi Record come moderato produttore di H2S.
Per la valutazione della frazione volatile e dei composti odorosamente attivi, i vini sono stati sottoposti ad analisi gascromatografica con rilevazione in spettrometria di massa (GC-MS) previa estrazione in fase solida SPE. Nel complesso sono stati identificati e quantificati nei vini 8 alcoli, 7 esteri, 3 acidi, 6 benzenoidi e 8 tra monoterpeni e norisoprenoidi. Il contenuto degli alcoli, in modo particolare quelli a 6 atomi di carbonio descritti come caratterizzati da note erbacee o amiliche, è per lo più influenzato dalla provenienza delle uve, sebbene le concentrazioni rilevate risultino tutte al di sotto delle soglie di percezione di questi composti. Derivati dal metabolismo del lievito invece sono gli alcoli isoamilici (2 e 3 metil 1 butanolo) e il 2 fenil etanolo. Nelle prove svolte mentre i primi, responsabili di aromi erbacei e soppressori delle note fruttate, appaiono in tutte le tesi al di sotto della soglia di percezione a indicare una scarsa influenza del ceppo ExperTi Record nella loro produzione, per il 2 fenil etanolo, il cui contributo è quello caratteristico della nota di rosa, si osservano valori di concentrazione interessanti e significativi (Fig. 5).
Gli esteri prodotti nel corso della fermentazione alcolica sono i principali responsabili dell’aroma fruttato dei vini e come è noto sono le caratteristiche genetiche del ceppo di lievito a rappresentare il fattore che più ne determina la produzione, insieme ad altre variabili che a loro volta influenzano il metabolismo del lievito, come la temperatura e la presenza di azoto disponibile. Nei vini della sperimentazione si osservano per alcuni degli esteri prodotti valori al di sopra delle soglie di percezione, in grado di influenzare favorevolmente l’aroma del vino, in particolare in relazione all’acetato di isoamile, all’etil esanoato e all’etil ottanoato (Fig. 6).
Nel caso di uve neutre quali Corvina e Corvinone, il contenuto in monoterpeni e norisoprenoidi dei vini è legato alla trasformazione di precursori presenti nell’uva ad opera delle glicosidasi del lievito. Le concentrazioni riscontrate in questo studio, sebbene generalmente troppo basse da poter ipotizzare un possibile contributo sensoriale, sono variate notevolmente in funzione del lotto di uva impiegato (Fig. 7) e indicano di conseguenza la presenza delle glicosidasi specifiche tra le attività enzimatiche del ceppo ExperTi Record, in grado di favorire l’espressione del potenziale aromatico delle uve. In aggiunta a questo appare interessante notare anche la presenza di una correlazione positiva tra le concentrazioni di geraniolo e di beta-citronello, composto attivo che si ottiene a partire dal geraniolo per azione delle attività reduttasi del lievito, evidentemente presenti e potenzialmente interessanti anche per la trasformazione di altri precursori di metaboliti ad elevata attività odorosa, quali il beta-damascenone e il cis-rose oxide, tipici della maturità dei vini.
Confermando quello che già era stato verificato nelle numerose esperienze di applicazione in cantina, i risultati della sperimentazione evidenziano le ottime capacità fermentative del ceppo ExperTi Record, che lo rendono in grado di sviluppare concentrazioni molto alte di alcol anche in condizioni limitanti di disponibilità azotata nei mosti. L’indicazione per i produttori in condizioni di carenze marcate, come alcune di quelle evidenziate, tuttavia è naturalmente quella di supportare il lievito con un’adeguata nutrizione azotata, utile anche nella limitazione della produzione di H2S nel corso della fermentazione. Da sottolineare in modo particolare nel riassumere i risultati è la bassa produzione di acido acetico, compresa nelle prove sperimentali tra valori minimi di 0,2 e massimi di 0,5 per le tesi più carenti in sostanze azotate. Il contributo aromatico nella produzione di composti volatili odorosamente attivi è stato evidenziato da un lato con la produzione di 2-fenil etanolo e di esteri fruttati, al di sopra delle loro soglie di percezione, e dall’altro con la presenza di attività enzimatiche glucosidasiche e reduttasiche, in grado di contribuire alla rivelazione di metaboliti aromatici presenti in forma di precursori glicosidici, nonché alla loro successiva trasformazione in altri metaboliti ad attività odorosa.